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SMART-Seq® HT Kit
品牌 Code No. 包装量 价钱 说明书 数目
Clontech 634436 480 Rxns 145,381 元
Clontech 634437 96 Rxns 45,432 元
Clontech 634438 192 Rxns 72,691 元
Clontech 634439 96 Rxns 1,199 元
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Code No. 产品名称
634436   SMART-Seq® HT Kit
634437   SMART-Seq® HT Kit
634438   SMART-Seq® HT Kit
634439   SMART-Seq® HT Lysis Components
 
SMART-Seq HT Kit:下通量的单细胞mRNA-seq剖析
 
· 下灵敏度 - 能够从单细胞或10 pg总RNA肇端制备cDNA(肇端量:1-100个细胞或10 pg-1 ng总RNA)
· 下质量的测序数据 - 正在SMARTer Ultra Low系列中基因检测数最多;保存全长基因信息,低rRNA比率,有用扩增GC-rich转录本
· 轻便的事情流程 - 只需经由过程一步RT-PCR回响反映,便可制备cDNA文库
· 简朴的样品制备 - 间接以细胞肇端的单管操纵流程,有助于连结样品的完整性
 
SMART-Seq HT试剂盒旨在以下通量的体式格局从1-100个细胞或10 pg-1 ng总RNA制备下品格的全长cDNA。该试剂盒是从第4代的SMARTER Ultra Low试剂(SMART-Seq v4)生长而去的,具有简化的操纵流程,将原有的逆转录和PCR扩增步调整合为一步,且不影响机能。细胞星散或RNA提取后,仅经由过程一步RT-PCR扩增单链cDNA,然后停止纯化完成操纵。
cDNA分解可正在4小时内完成,全部文库构建计划可正在2天内完成。并且,SMART-Seq HT试剂盒具有取SMART-Seq v4试剂盒雷同的灵敏度和可重复性。
本试剂的核心技术-SMART手艺,是一种对齐转录组研讨,和包孕细胞内剪接位点,可变剪接研讨的异常壮大的东西,且能够检测全长基因。 Oligo(dT)能够从下品格总RNA(RIN> 8)或完好细胞中特异性扩增mRNA。 经由过程接纳LNA手艺,提拔了模板转换的效力,那使得本试剂能够检测到比任何以往SMARTer Ultra Low更多的基因。
图1 SMART-Seq HT的手艺流程
 
图2 SMART-Seq v4和SMART-Seq HT事情流程的对照
 
SMART-Seq HT(左)是由SMART-Seq v4要领(左)经由改进而去的一个手动操纵工夫更短的下通量事情流程。运用FACS要领得到单细胞,SMART-Seq HT试剂盒只需3个操纵步调便可制备cDNA,而SMART-Seq v4试剂盒需求6步。SMART-Seq HT事情流程的一个主要步调是一步RT-PCR,即运用一步RT-PCR缓冲液,停止高效的逆转录和PCR cDNA扩增的历程。 一步RT-PCR缓冲液取AMPure bead纯化兼容,无需增加裂解缓冲液。取SMART-Seq v4试剂盒一样,SMART-Seq HT试剂盒正在将cDNA用于测叙文库制备(Nextera® XT)之前需求做质量掌握(定量和巨细散布)。
 
图3 运用SMART-seq v4 kit和SMART-Seq HT kit从FACS分选的293T细胞中得到的下重复性的基因表达数据
 
运用SMART-Seq v4试剂盒(SSv4_1-SSv4_12)和SMART-Seq HT试剂盒( HT_1-HT_9)(上图)从21个293T细胞单细胞制备文库,并对每一个细胞得到的基因表达性停止评价。条理聚类热图展现了一切细胞之间的Euclidean distances,并显现从0.74到0.97的Pearson相关性。不只用雷同试剂盒制备的细胞之间能够观察到异常下的相关性,而正在两种试剂盒之间的相关性也异常下。这些数据注解,SMART-Seq HT的事情流程取SMART-Seq v4比拟,正在基因表达剖析中没有明显的偏向。
 
图4 SMART-Seq v4 kit和SMART-Seq HT kit之间基因GC含量的表达程度对照
 
剖析由10 pg小鼠脑总RNA制备的文库的GC含量示意(拜见表格,上图)。经由过程GC含量对基因停止分类,并应用散点图显现每一个分类中基因的表达程度(FPKM)的重现性。运用SMART-Seq v4(Panel B)或SMART-Seq HT试剂盒(Panel C)剖析,基因表达程度显现反复之间的异常下的重现性。GC含量下或低的基因(离别以赤色和蓝色显现)正在SMART-Seq v4和SMART-Seq HT试剂盒(Panel D)中显现类似的表达程度。因而,正在新的SMART-seq HT试剂盒中引入的一步式RT- PCR回响反映不影响低和下GC含量基因的表达。
图5 运用SMART-Seq v4和SMART-Seq HT试剂盒审定的转录本高度堆叠
 
剖析10 pg小鼠脑总RNA制备的文库中,每一个试剂盒的三个反复之间检测到的转录本数量(FPKM> 0.1)的堆叠状况,发明异常类似(SMART- Seq v 4:61%,SMART-Seq HT:63%)(Panel B)。另外,对每一个试剂盒的一切反复的转录本停止那两个试剂盒之间的对照,注解堆叠比例为71%,堆叠转录本的均匀表达程度为37个FPKM。但正在每一个试剂盒中检测到的非堆叠转录本,均匀表达程度为6-7个FPKM,均较低。那也注解,低程度表达的转录本不容易被辨认。
 
Technote:
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视频材料:下通量单细胞全长转录组解决方案
Takara Bio USA公司Dr. Ankita Das引见了能够实现较下通量单细胞全长转录组分析的SMART-Seq HT Kit。